免疫印跡法(WB)、免疫組化(IHC)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，是免疫學常用工具，主要應用于蛋白的定位、定性和定量。
其中 WB實驗是先通過進行跑電泳后，然后將分離好的蛋白質樣品轉移到固相載體上，再利用抗原-抗體-標記物顯色來檢測樣品，常用于定性和半定量。
圖｜ WB實驗流程圖
以上產品，李記均有充足庫存，蛋白Mark和ECL化學發光液都有試用裝，現在申請還有*等你參與，請咨詢銷售小伙伴們~
在8月10號的活動中，恭喜齊*新小伙伴喜提2張上海迪士尼門票！
【小李劇透】十月份還有某游樂園福利嗷~敬請期待！
WB實驗常見十問
1、細胞水平做WB，一般多少數量細胞提的蛋白夠做WB？做組織樣品的WB的時候,怎樣處理樣品？
答：一般5×10^6就足夠了；特殊情況需根據自己的研究來確定。
必須進行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫)，蛋白質溶解度會更好，離心要充分(12000轉/min，10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2、蛋白變性后可以存放多久？
答：-80℃，若沒有反復取出凍融，保存一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
3、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的WB檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品；有時如果抗體特異性高且效價高，同時使用2種一抗，可在一張膜上檢測2種不同蛋白。
4、上樣超載多少會對實驗有影響？可以用什么方法來增加上樣量？
答：正常超載30％不會有問題的，但不建議超載加樣。
可以濃縮樣品，或者根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白，還可以考慮加大膠的厚度，以增大上樣孔體積，比如嘗試1.5mm厚的膠。
5、我所測定的蛋白分子量是100KD左右，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會發生一定地偏移。具體參照如下圖(李記有3款預混膠、預制膠，詳情請參考“關于蛋白電泳那些事")
6、一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？
答：WB一般上樣30-100μg不等，結果跟目的蛋白的表達豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。
最開始摸條件時，各個步驟都可以量多一點時間長一點(背景也容易就出來了)。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復測試。
7、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持冰浴，保持低溫。除非有文獻特別指明必須使用特殊方法，一般來說沒有區別。
8、轉膜后經麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉膜表現不是很好？
答：這是正常的，大分子的蛋白轉移很慢，你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡(轉過的表現)。注意一點：麗春紅染色較好，不是你的目標蛋白成功轉移至膜上的標準，只能作為一個粗略參考。
9、做半定量WB，內參β-actin，GAPDH哪個好？
答：一般選用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。
10、請問一下PVDF膜和NC膜的區別是什么？為什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，有疏水作用但相對較弱，和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
硝酸纖維素膜(NC膜)是通過疏水作用來和蛋白質相聯，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。
#土味情話大賽#
在本篇微信文章的文末評論區留言，李記會篩選出符合主題的留言參與評選，關注微信公眾號且點贊數在前5名就有愛的好禮相送哦！
舉個栗子
翠花：你在我心底的影響因子怎么越來越高了呢？
鐵柱：錯過了Nature，錯過了Science，錯過了Cell，不能錯過你！
留言要求
1.留言要土土土！要走心，要含有科研元素。
2.不按留言順序選擇，按留言質量選擇，所以留言早，留言質量低的不一定會被選中。
3.留言排名在8月13號中午12:00點截止，且在評論區公布獲獎名單。
4.本活動需關注李記生物微信公眾號后參與。
獎品一覽
1.第一名(1人):價值300元的海底撈禮品卡一張
2.第二名(1人):價值200元的哈根達斯禮品卡一張
3.第三、四、五名(3人):價值100元的星巴克禮品卡一張
活動時間：2021.8.10-2021.8.13
活動編號：Li210810H
活動范圍：全國生物相關終端客戶
更新時間：2021-08-18
點擊次數：3811
當前位置：
服務熱線
上海市浦東新區紫萍路908弄
lsj0027@obiosh.com